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中科院生物物理所在CRISPR-Cas12a系統R-loop復合體形成機制方面取得進展

2020/1/16編輯:Ma Liang 人氣:2862

  【阿儀網 實驗室動態】2020年1月14日,Chemical Communications雜志在線發表了中國科學院生物物理研究所婁繼忠課題組關于CRISPR-Cas12a系統R-loop復合體的分子機制的最新研究成果,題為Direct Observation of the Formation of CRISPR-Cas12a R-loop Complex at the Single-Molecule Level。

  CRSPR-Cas12a系統屬于TypeⅤ型CRISPR系統。該系統具有許多與Cas9系統不同的特性:首先,Cas12a只需要crRNA即可對靶DNA進行識別與切割,不需要tracerRNA的參與,因而系統更加簡單;其次,與Cas9蛋白不同,Cas12a識別的PAM序列為富胸腺嘧啶(T)序列,可以擴展CRISPR的編輯范圍;另外,Cas12a切割靶DNA產生粘性末端,更加有利于目的基因的插入;一系列研究還發現,Cas12a在具有相近的編輯效率前提下,具有比Cas9更低的脫靶率。

  在本項研究中,婁繼忠課題組利用自主搭建的高分辨光鑷儀器,并結合生物化學、單分子熒光等手段對氨基酸球菌屬Cas12a (Acidaminococcus sp. Cas12a, AsCas12a) 蛋白R-loop復合體的形成及結構穩定性進行了較為系統的研究。研究發現,當crRNA和靶DNA的堿基配對長度達到18bp時,R-loop結構達到一種穩定的檢查點狀態,此時Cas12a采取一種活性構象為隨后靶DNA的切割做準備。一旦穩定的R-loop結構形成,Cas12a會率先對非目標鏈進行切割,由于非目標連與Cas12a的結合相對松散,因此它會很容易地從Cas12a酶切中心釋放出來,隨后閑置的RuvC活性中心又會和目標鏈結合并進行切割。由于受到Cas12a保護的RNA-DNA雜合雙鏈的長度被限制在20bp,20bp外的DNA目標鏈呈現為單鏈形式,因此很容易與Cas12a的酶切中心結合。在這一過程中,Cas12a的Nuc結構域通過與非目標DNA的結合,抑制靶DNA雙鏈的再退火從而穩定形成R-loop結構。

  研究員婁繼忠與副研究員宋廣濤為論文的共同通訊作者,博士生崔洋為論文的第一作者。哈爾濱工業大學教授王雷課題組在光鑷儀器搭建及電路調試方面提供了幫助。該項研究得到國家自然科學基金(項目編號:31771015,11672317)的資助。

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(來源: 中國科學院科技產業網 )

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